液相色谱法检测棉籽粕中的氨基酸

摘要：采用柱前衍生反相液相色谱法分析棉籽粕中十八中氨基酸，衍生试剂为优选的某试剂，流动相为醋酸盐缓冲溶液、乙腈、水，二元梯度洗脱，色谱柱为AAK氨基酸柱，紫外检测。该方法使用液相色谱仪，定性重复性好，定量准确。

    关键词：液相色谱、氨基酸、棉籽粕

*，蛋白质是饲料中zui主要的营养指标之一，动物通过从饲料中攫取蛋白质，在其肠道中被分解成氨基酸而被机体吸收，从而合成自身的蛋白质，满足机体自身的生长发育的需要，因此，饲料中充足的蛋白质有利于动物机体充分发挥生长潜能。由于蛋白质饲料营养价值zui为根本的决定因素是其氨基酸组成，因此近年来越来越多的企业注重对蛋白质饲料氨基酸组成的分析，从氨基酸水平上评估蛋白质饲料及配合饲料的品质。

我国长江、黄河中下游和新疆地区为棉花主产区，每年可提供约600万吨棉籽，制油后棉籽饼粕总产量约300万吨，故棉籽粕是我国重要的蛋白质饲料资源。棉籽粕含有的粗蛋白可达40%以上。棉籽粕作为蛋白质饲料的主要资源之一，除了要关注它的蛋白质含量，对其氨基酸组成的分析也成为关注的焦点。

目前，饲料中氨基酸的测定主要是根据GB/T 18246-2000 《饲料中氨基酸的测定》方法来测定的，该方法是利用氨基酸分析仪来测定的，且对各种不同的氨基酸前处理方法不同，前处理方法比较复杂。

本文利用优选的衍生试剂，通过柱前衍生，利用液相色谱来分析棉籽粕中的十八种氨基酸。

1         实验部分

1.1    仪器及试剂

1.1.1         试剂及试剂的配制

1.1.1.1    乙腈（色谱纯）；

1.1.1.2 水（超纯水）；

1.1.1.3 醋酸钠（分析纯）；

1.1.1.4 冰乙酸（分析纯）；

1.1.1.5 *（分析纯）；

1.1.1.6 N，N-二甲基甲酰胺（分析纯）；

1.1.1.7 碳酸氢钠（优级纯）；

1.1.1.8 磷酸二氢钾（优级纯）；

1.1.1.9 氢氧化钠（优级纯）；

1.1.1.10 色氨酸标样（中国标准物质中心）；

1.1.1.11 17种氨基酸混合标样（中国标准物质中心，混合标样中17种氨基酸的浓度见表一）；

表一 十七种氨基酸标样中各氨基酸浓度

1.1.1.12 饲料参比（中国标准物质中心，饲料参比的百分含量见表二）；

表二 饲料参比的百分含量

1.1.1.13 色氨酸标样配制：称取适量色氨酸标准品，用氢氧化钠溶液溶解配制成浓度为2μmol/mL溶液，即20.42mg/100mL；

1.1.1.14 6 mol/L盐酸配制：用浓盐酸和水1：1配置即可；

1.1.1.15 5 mol/L氢氧化钠的配制：称取200g氢氧化钠配成1L水溶液；

1.1.1.16 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠配成100mL水溶液；

1.1.1.17 衍生缓冲液：4%碳酸氢钠水溶液；

1.1.1.18 衍生试剂：适量衍生试剂用乙腈定容为100mL；

1.1.1.19 平衡缓冲液：0.68%磷酸二氢钾水溶液。

1.1.2 仪器

液相色谱仪

大连依利特AAK氨基酸柱（4.6mm×250mm）

水解管：硬质玻璃管，体积20～30mL

恒温干燥箱、真空泵、漩涡混匀器、酒精喷灯等

1.2    仪器条件

检 测 器：紫外可见检测器；

检测波长：360nm；

色 谱 柱： AAK氨基酸柱（4.6mm×250mm）；

流 动 相：流动相A：乙腈：水＝1：1；

流动相 B：0.05mol/L醋酸钠溶液（称取4.1g醋酸钠，0.4g*，加水900mL溶解，加入10mL N，N－二甲基甲酰胺，用冰乙酸调pH值为6.4，用水定容为1000mL）；

流速：1.2mL/min；

柱温：27℃；

进样量：20μL。

表三 梯度洗脱时间表

1.3    样品处理过程

1.3.1 样品和饲料参比水解：

1.3.1.1 对于除色氨酸以外的十七种氨基酸用酸水解：准确称量粉碎混匀的样品适量，使样品氨基酸总量在约100mg范围内，置于水解管中，加入6mol/L盐酸10mL左右，用酒精    

喷灯封口，然后放入145℃的烘箱中水解4h，取出冷却后，打开水解管封口，将水解液全部用滤纸过滤到50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，供衍生使用。

1.3.1.2 对于色氨酸用碱水解：准确称量粉碎混匀的样品适量，使样品氨基酸总量在约100mg范围内，置于于水解管中，加入5mol/L氢氧化钠10mL左右，放置30min以后，用酒精喷灯封口，然后放入145℃的烘箱中水解4h，取出冷却后，将水解液全部转移到50mL的容量瓶中，先用6mol/L盐酸10mL左右中和，再用水定容至刻度，混匀，供衍生使用。

1.3.1.3 由于酸水解过程中含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）部分被氧化不能测准，所以要用饲料参比来加以校正，饲料参比用酸水解：准确称量粉碎混匀的样品适量，使样品氨基酸总量在60～100mg范围内，置于水解管中，加入6mol/L盐酸10mL左右，用酒精喷灯封口，然后放入145℃的烘箱中水解4h，取出冷却后，打开水解管封口，将水解液全部用滤纸过滤到50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，供衍生使用。

1.3.2 标样和样品衍生

1.3.2.1 十七种氨基酸标样、饲料参比和样品酸水解的水解液的衍生过程：用注射器准确吸取样品水解液适量于小试管底部中；将小试管置于真空瓶或者真空干燥器中，抽干；用移液枪加入适量衍生缓冲液，漩涡混合；用移液枪加入定量衍生试剂，漩涡混合，用封口膜封口，置于60℃烘箱中反应30min；取出冷却后用移液枪加入160μL平衡缓冲液，漩涡混合，取20μL进样。

1.3.2.2 色氨酸标样、样品碱水解的水解液的衍生过程：用注射器准确吸取样品水解液适量于小试管底部；将小试管置于真空瓶或者真空干燥器中，抽干；用移液枪加入适量衍生缓冲液，漩涡混合；用移液枪加入定量衍生试剂，漩涡混合，用封口膜封口，置于60℃烘箱中反应30min；取出冷却后用移液枪加入160μL平衡缓冲液，漩涡混合，取20μL进样。

2         结果与讨论

2.1 专属性

图一 十七种氨基酸的色谱图

十七种氨基酸的出峰顺序：1、天冬氨酸；2、谷氨酸；3、丝氨酸；4、精氨酸；5、甘氨酸；6、苏氨酸；7、脯氨酸；8、丙氨酸；9、缬氨酸；10、蛋氨酸；11、胱氨酸；12、异亮氨酸；13、亮氨酸；14、苯丙氨酸；15、组氨酸；16、赖氨酸；17、酪氨酸。

从图一中可以看出，除了苯丙氨酸和组氨酸没有分开之外，其余各峰均分离良好，苯丙氨酸和组氨酸可以用切分峰的方法进行计算。

2.2 饲料参比的作用

由于酸水解过程中含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）部分被氧化而不能测准，所以要用饲料参比来加以校正。校正的方法是，通过用饲料参比中蛋氨酸和半胱氨酸的含量来校正标样中蛋氨酸和半胱氨酸的浓度含量，从而使得标样中蛋氨酸和半胱氨酸的含量准确，再用标样去定量样品中氨基酸含量。

2.3 色氨酸的检测

    色氨酸用提供的色谱条件就可以进行检测，可以得到分离良好的色谱图，如图二所示：

图二 色氨酸色谱图

2.4 棉籽粕样品的分析结果

新疆棉籽粕的粗蛋白含量基本在42%~46%之间，此类棉籽粕的粗蛋白含量是很高的，很适合于做蛋白质饲料，能够测出此类棉籽粕的各种氨基酸的含量，尤其是必需氨基酸（赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等）的含量，可以以此来评价棉粕的品质，并且可以为配合氨基酸成分平衡的饲料提供参考依据。表三 为新疆金鑫科技棉籽粕样品的氨基酸分析结果。

表四  新疆金鑫科技棉籽粕样品的氨基酸分析结果

3         结论

    通过酸水解前处理的方法和饲料参比校正的数据处理可以同时检测棉籽粕中十七种氨基酸，通过碱水解的方法可以检测棉籽粕中的色氨酸。该衍生化方法简便、产物稳定，过量的衍生化试剂以及反应产生的副产物对检测没有影响。二元高压系统流量精度高，保留时间重复性好，紫外检测器性能稳定。该方法可广泛应用于饲料、食品、生化、医药等分析领域。