液相色谱法测定红豆杉组织培养物中 sinenxans含量方法

仪器与试剂Shimadzu LC-6A型液相色谱仪；SPD—6A型UV检测器；C—R3A型积分仪。
甲醇为优级纯（北京化工厂）；乙腈为色谱纯（天津四友生物医学技术开发公司）；水为双蒸水。三者均经G5漏斗过滤。2 对照品的制备
分别精密称取sinenxan A、sinenxan B和sinenxan C各1.0mg，以甲醇配
制成1.0mg/mL的对照品混合溶液。
Sinenxan A、sinenxan B和sinenxan C均从红豆杉（Taxus chinensis）组织培养物中分离得到其结构由NMR与MS确定，其纯度经HPLC测定均达到99.0%以上。3 色谱条件预柱：Sep-Pak C18柱；色谱柱：Spherisorb C18（5μm，4.6mm×250mm）不锈钢柱。
流动相：甲醇—乙腈—水（65∶15∶20）；流速：1.0mL/min；检测波长：227nm；积分仪衰减：2；纸速：0.1cm/min；灵敏度AUFS：0.02；柱温：室温。4 样品液的制备 收获待测的培养物，在60℃以下烘干至恒重，研细，过40目筛为样品。
精密称取1.0g，以石油醚（60～90℃）—丙酮（5∶20）超声波提取30min，过滤。滤渣以丙酮洗涤3次。合并滤液，浓缩至干得粗提物。以1.0mL甲醇溶解，吸取50μL加于Sep-Pak C18预柱端。分别以水、70%甲醇和90%甲醇各4mL洗脱。收集90%甲醇洗脱液，蒸干溶剂，以甲醇定容1mL为样品液。5 对照品的保留时间吸取sinenxan A、sinenxan B和sinenxan C的对照品混合溶液10μL进样.

回收率试验 精密称取1.0g已知含量的样品，按照“样品液的制备”项下“以石油醚（60～90℃）—丙酮（5∶20）超声波提取30min”至“浓缩至干得粗提物”的方法操作，精密吸取10μL对照品混合溶液，加入所得粗提物中，按照“样品液的制备”项下“以1.0mL甲醇溶解”至“以甲醇定容1mL为样品液”的方法操作，制成回收试验样品液。
精密吸取回收试验样品液2μL进行测定，所得结果代入回归方程，计算回收率。sinenxan A、sinenxan B和sinenxan C的平均回收率（n=3）分别为：（104.4±0.41）%、（103.7±0.47）%、（99.04±0.52）%。8 样品测定 精密吸取按“样品液的制备”项下方法制备的样品液2μL进行测定，所得结果代入回归方程，计算含量。每个样品进样2次，以平均数为测定结果。

讨论
9.1 流动相的选择 根据文献报道［2］及作者实验总结，运用HPLC进行紫杉烷类成分的分析测定，流动相的组成以甲醇—乙腈—水为较好，其中，乙腈与水的比例决定着色谱峰的形状及分离效果，甲醇决定着色谱峰的保留时间（tR）。针对本文sinenxans的测定，选定配比为65∶15∶20的甲醇—乙腈—水作为*流动相。若减小甲醇的比例，将会延长样品的测定时间，且较后出峰的sinenxan C会出现拖尾现象；如增大甲醇的比例，sinenxan各色谱峰的保留时间均可显著缩短，然而在进行样品分析时，由于存在其他成分色谱峰的干扰，会影响测定结果的准确度。
9.2 被测组分的含量水平会因培养物样品之间存在较为显著的差异而有所不同。可根据具体情况调整样品液的浓度和/或进样量，以满足样品的测定要求，得到准确的测定结果